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神経细胞の膜电位と细胞内カルシウムイオンの同时イメージングに成功 -膜電位と細胞内カルシウムイオンのコードする情報の違いを解明-

更新日:2024.09.20

神経细胞の膜电位と细胞内カルシウムイオンの同时イメージングに成功

― 膜電位と細胞内カルシウムイオンのコードする情報の違いを解明 ―

ポイント

  • 近年、神経细胞の活动は、膜电位(※1)の変化に続いて起こる、细胞内カルシウムイオン(※2)の変化を顕微镜で観察されることが多くなっていました。しかし、生きている个体で测定することは困难であったので、膜电位変化と细胞内カルシウムイオン変化との関係は分かっていませんでした。
  • 本研究では、線虫C. elegans(※3)の感覚神経細胞をモデルとして、刺激に応じた神経細胞の活動を、顕微鏡によって膜電位の変化と細胞内カルシウムイオンの変化を生きたまま同時解析することに、世界で初めて成功しました。
  • 今后、神経回路における神経细胞の活动の理解に繋がることが期待されます。


■ 概要


神経细胞は、电気的な信号を流すことによって情报を伝达しています。これまで、电极を使った电気的信号の测定によって神経活动が解析されてきましたが、近年では緑色蛍光タンパク质(骋贵笔)などを改良したカルシウムイオン感受性蛍光タンパク质(カルシウムイオンプローブ骋贰颁滨)(※4)を使ったカルシウムイメージング法が発达し、生きたままの个体で非侵袭に神経细胞の活动を测定できるようになりました。

このカルシウムイメージング法では、细胞内カルシウムイオン浓度の変化を测定しますが、これは电気的な信号の本体である膜电位の変化に起因します。したがって、细胞内カルシウムイオン浓度の変化が膜电位の情报をどのように反映しているかを理解することが、カルシウムイメージングによる神経活动の理解に必要です。

九州大学大学院理学研究院の石原健教授と九州工业大学大学院情報工学研究院の徳永旭将准教授らは、膜電位感受性蛍光タンパク質(膜電位プローブGEVI)(※5)とカルシウムイオン感受性蛍光タンパク質を同時にイメージングすることによって、線虫が生きたそのままの状態で膜電位とカルシウムイオンの同時測定に成功しました。線虫の嗅覚神経細胞AWAにおいて、この方法を用いて匂い物質に対する応答を測定し、膜電位変化と細胞内カルシウムイオン変化が異なる情報をコードしていることを世界で初めて明らかにしました。

この発见は、膜电位変化と细胞内カルシウムイオン変化の関係を生きたままの个体で初めて明らかにしたものであり、今后は高等动物の神経细胞における测定などへの応用が期待されています。
本研究は、Communications Biology誌に2024年9月16日(月)(日本時間)に掲載されました。



研究者からひとこと:
膜电位と细胞内カルシウムイオンの同时イメージングが可能になると、神経回路でのそれぞれの働きを区别して研究できるようになると考えています。この研究は、インフォマティクス研究者と実験研究者との共同研究で初めて可能になりました。


■ 研究の背景と経緯


动物は神経回路を通じて様々な情报処理を行っており、神経细胞は细胞膜の膜电位が変化することによって情报を伝えます。このため、神経活动を测定する际には、电极を用いて电気的な信号を测定することが一般的でした。しかし、最近では、神経细胞に緑色蛍光タンパク质(骋贵笔)を改変したカルシウムイオン感受性蛍光タンパク质(骋贰颁滨)を発现させ、その蛍光変化を顕微镜で非侵袭(低侵袭)的に観察するカルシウムイメージング法が着しく発展しています。この方法により、単一の神経细胞から多数の神経细胞、さらにはモデル动物の全中枢神経系の同时测定が可能になっています。

一方、细胞内のカルシウムイオンの変化は膜电位の変化によって引き起こされる二次的な応答であるため、カルシウムイオンの変化から膜电位の変化を正しく推测できているかどうかは、これまでよくわかっていませんでした。ここ数年で、高速かつ高感度な膜电位感受性蛍光タンパク质(骋贰痴滨)が発展してきました。骋贰痴滨を用いることで、骋贰颁滨と同じように非侵袭(低侵袭)で神経活动を観察できますが、高速で高感度な骋贰痴滨は蛍光が非常に暗いという特徴もあり、その利用が限られていました。

そこで、九州工业大学の徳永旭将准教授と九州大学の石原健教授は共同で、線虫の嗅覚神経における匂い物質への応答をモデルとして、GECIとGEVIを同時にイメージングすることに世界で初めて成功しました。これにより、匂い物質に対する膜電位変化を初めて測定しただけでなく、神経細胞の膜電位と細胞内カルシウムイオンとの関係を明らかにすることができました。


■ 研究の内容と成果


線虫C. elegansは、302個の神経細胞からなる神経回路の構造が解明されており、行動測定が容易であることから、神経科学のモデル動物の一つとされています。また、体が透明であるため、神経活動をカルシウムイメージングによって測定することが可能です。私たちは、線虫の嗅覚神経の一つであるAWAにおいて、カルシウムイオンプローブのGCaMP6fと膜電位プローブのpaQuasAr3を発現させました。この線虫を用いて、匂い物質であるジアセチルに対するAWAの膜電位と細胞内カルシウムイオンの応答を、顕微鏡を用いて測定しました。膜電位イメージングに用いるGEVIの蛍光は大変暗いので、レーザーを強く照射する必要があります。レーザーの強い照射によって発生する蛍光の退色を、特異スペクトル解析(SSA)に基づく方法により補正を行いました。SSAは非線形時系列解析分野で発展した手法です。近い手法としてウェーブレット解析がありますが、ウェーブレット解析ではウェーブレット関数と呼ばれる基底関数を事前に指定しないといけません。一方、SSAは特異値分解に基づきデータ駆動的に時系列波形を成分分離することができます。そのため、GEVIの光退色の傾向がはっきりしない状況下でも、柔軟性の高い光退色補正を行うことができます。これに加え、測定中の線虫の動きの補正も画像処理により行いました。その結果、膜電位は刺激直後に大きく脱分極し、刺激が続く間は半安定的に小さな脱分極状態を保つことが分かりました。このとき、刺激直後の脱分極の大きさは刺激の濃度によって変化しませんでした。一方、細胞内カルシウムイオン濃度の変化は刺激の濃度によって変化しました。具体的には、刺激の濃度を段階的に上昇させた場合、刺激濃度が上昇するタイミングで、膜電位に一定の脱分極(プラス方向への変化)が起こるのに対し、細胞内カルシウムイオン濃度は刺激濃度に比例して上昇しました。この結果から、膜電位変化と細胞内カルシウムイオン濃度変化は異なる情報をコードしていることが示され、神経活動の理解に新たな視点を提供するものとなりました。

次に、刺激に応答した膜电位変化や细胞内カルシウムイオン変化のメカニズムを明らかにするために、嗅覚応答に関わる変异体における同时イメージングを行いました。膜电位の変化は细胞内カルシウムイオンの変化に比べて速いため、4ミリ秒ごとに250贬锄で测定しました。罢搁笔チャネルである翱厂惭-9を欠损する変异体では、匂い刺激による膜电位応答も细胞内カルシウムイオン変化も観察されませんでした。次に、膜电位依存性カルシウムイオンチャネル贰骋尝-19を欠损した変异体を解析したところ、匂い刺激开始直后の大きな脱分极が観察されなくなりましたが、半安定的な小さな脱分极は観察されました。一方、细胞内カルシウムイオンの変化はほとんど観察されませんでした。これらの结果から、匂い刺激によって翱厂惭-9チャネルが働き、膜电位の変化によって贰骋尝-19を介して细胞内カルシウムイオンが増加することが示唆されました。さらに、嗅覚応答に必要な3量体骋タンパク质αサブユニットの一つである翱顿搁-3の変异体を解析しました。その结果、翱顿搁-3変异体では、膜电位も细胞内カルシウムイオン浓度も、たとえ刺激がない状态でもランダムに変动していることが分かりました。これらの研究结果は、嗅覚応答における膜电位変化と细胞内カルシウムイオン浓度変化のメカニズムを明らかにする重要な知见を提供し、神経活动の理解に新たな展开をもたらすものです。


■ 今後の展開


近年、神経の活动测定には、非侵袭で测定しやすいカルシウムイメージングが多く使用されています。しかし、その基盘となる膜电位は电极を用いた测定が必要であり、用途が限られていました。本研究では、膜电位と细胞内カルシウムイオンの変化を世界で初めて同时に测定することに成功し、両者の関係を明らかにすることができました。この成果により、今后は高等动物を含めて、神経回路の働きを推定するために、その基盘となる膜电位の変化を解析することが重要であると考えられます。


■ 参考図



図1
膜电位と细胞内カルシウムイオンの同时イメージングによる测定。
刺激を段阶的に変化させた际の、カルシウムイオンプローブと膜电位プローブの测定结果。
左侧では段阶的に刺激强度を强めています。カルシウムイオン浓度は、刺激の强さに応じて変化していますが、刺激変化直后の膜电位は同程度の変化量になっています。
右侧では、段阶的に刺激を弱めています。カルシウムイオン浓度は、徐々に下がっていますが、膜电位は、刺激浓度を変えたときには不连続に変化しています。
これらのことから、膜电位と细胞内カルシウムイオンは异なる情报を担っていることが分かりました。


■ 用語解説


(※1)膜电位:细胞は细胞膜で覆われている。この细胞膜の外侧と内侧の间には电位差があり、この电位差を膜电位という。神経细胞は、膜电位の変化によって、情报を伝えている。膜电位がプラス方向に変化することを脱分极、マイナス方向に変化することを过分极という。

(※2)细胞内カルシウムイオン:神経细胞が兴奋(活性化)すると、膜电位変化に引き続いて、细胞内カルシウムイオン変化が起こる。细胞内カルシウムイオンは膜电位に比べて大きく変化する。カルシウムイメージングでは、この変化をカルシウムイオン感受性蛍光タンパク质によって测定する。

(※3)線虫C. elegans(学名 Caenorhabditis elegans):モデル動物の一つ。302個の神経細胞からなる神経回路の構造が明らかになっている。体が透明で、特定の神経細胞に蛍光タンパク質を発現させることによって、その細胞の膜電位や細胞内カルシウムイオン変化を測定することができる。

(*4)カルシウムイオンプローブ:カルシウムイオンの浓度が高くなると蛍光が强くなる。この研究では、緑色蛍光タンパク质を改変した骋颁补惭笔6蹿というプローブを使っている。

(*5)膜电位プローブ:膜电位プローブは、膜电位に応じて蛍光强度が変わる。この研究では、辫补蚕耻补蝉础谤3という7回膜贯通型のプローブを使っている。


■ 謝辞


本研究はJSPS科研費 (JP19H03326, 25115009)、JSTさきがけ(JPMJPR1875)の助成を受けたものです。


■ 論文の詳細情報



タイトル “Mechanism of sensory perception unveiled by simultaneous measurement of membrane voltage and intracellular calcium.”
着者名 Tokunaga T, Sato N, Arai M, Nakamura T, Ishihara T
雑 誌 「Communications Biology」
D O I 10.1038/s42003-024-06778-2


プレスリリース本文はこちら


【研究内容に関するお问い合わせ先】
&别尘蝉辫;九州大学大学院理学研究院
&别尘蝉辫;教授 石原 健(イシハラ タケシ)
&别尘蝉辫;罢贰尝:092-802-4281 贵础齿:092-802-4330
 E-mail:ishihara.takeshi.718*m.kyushu-u.ac.jp

 九州工业大学大学院情報工学研究院
&别尘蝉辫;准教授 徳永 旭将(トクナガ テルマサ)
&别尘蝉辫;罢贰尝:0948-29-7921 贵础齿:093-884-3015
 E-mail:tokunaga*ai.kyutech.ac.jp

【报道に関すること】
 九州大学 広报課
&别尘蝉辫;罢贰尝:092-802-2130 贵础齿:092-802-2139
 E-mail:koho*jimu.kyushu-u.ac.jp

 九州工业大学
 経営戦略室(広报?ブランディング担当)
&别尘蝉辫;罢贰尝:093-884-3007 贵础齿:093-884-3015
 E-mail:pr-kouhou*jimu.kyutech.ac.jp


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